1,25(OH)_2D_3对牛肾细胞STC-1的表达作用及其凋亡的影响

【摘要】维生素D除具备经典的钙磷稳态调节作用外,还参与到机体免疫和内分泌代谢等多种生理功能的调节中,对奶牛钙磷代谢紊乱也有一定的治疗作用。STC-1是一种类糖蛋白激素,在哺乳动物的多种组织中都有分布和表达,研究表明其在体内可以通过促进磷酸盐的吸收和重吸收、抑制钙的吸收来维特钙磷稳态的平衡。维生素D作为一种类固醇激素,参与到内分泌系统的调节中,如抑制甲状旁腺素(PTH)的合成与分泌和调节降钙素(CT)的分泌,但是其对反刍动物斯钙素-1(STC-1)的影响未见文献报道。此外,维生素D对细胞增殖和凋亡也有一定作用,作为药物使用时具有一定毒性,因此对其主要作用器官肾脏可能会产生损害。综上所述,本实验的目的是研究1,25(OH)2D3对牛肾细胞(MDBK细胞)STC-1表达的影响及其机制,以及1,25(OH)2D3对牛肾细胞增殖凋亡的影响。本实验对牛肾细胞(MDBK细胞)进行培养,在细胞对数生长期添加1,25(OH)2D3处理。在探究1,25(OH)2D3对STC-1表达影响中,通过荧光定量PCR检测在1,25(OH)2D3对牛肾细胞STC-1的表达影响,并添加转录抑制剂放线菌素D(ActD)和蛋白抑制剂放线菌酮(CHX)以探究1,25(OH)2D3是否在基因表达的转录和翻译阶段起到调节作用。在探究1,25(OH)2D3对牛肾细胞凋亡的影响中,通过吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)对1,25(OH)2D3诱导凋亡的牛肾细胞进行染色,用荧光显微镜观察细胞形态学变化和凋亡情况,用流式细胞仪检测其凋亡率的变化,通过荧光定量PCR检测相关凋亡基因Fas,Bax,Bc1-2表达变化,从基因水平探究1,25(OH)2D3对诱导牛肾细胞凋亡发生的影响。结果分析如下：1.1,25(OH)2D3对牛肾细胞STC-1表达影响在1,25(OH)2D3处理12h后,不同浓度组的STC-1基因表达量都高于对照组,且在1.0nmol/L,l0nmol/L和100nmol/L上升极显著(P<0.01)。在100nmol/L1,25(OH)2D3牛肾细胞后,不同时间组的STC-1基因表达量高于对照组,且在12h,18h和24h上升极显著(P<0.01)。表明添加1,25(OH)2D3处理MDBK牛肾细胞后,STC-1的表达量发生上调,且这种上调呈现浓度和时间依赖性,随着1,25(OH)2D3浓度的升高和作用时间的延长,STC-1的表达量上升。在对MDBK牛肾细胞先添加4μg/mLActD处理1h,再添加1,25(OH)2D3处理8h后,STC-1基因表达相比对照组和仅添加ActD组呈现显著上调趋势,且与单独添加1,25(OH)2D3组无太大差异。在单独添加1,25(OH)2D3以及联合添加CHX和1,25(OH)2D3处理2h,4h,8h和24h后,STC-1基因表达量高于对照组,且上升极显著(P<0.01)。表明转录抑制剂ActD未对1,25(OH)2D3上调STC-1表达产生抑制作用,说明1,25(OH)2D3通过增加mRNA的稳定表达对STC-1起到上调作用,蛋白合成抑制剂CHX对1,25(OH)2D3上调STC-1表达产生一定抑制作用,表明翻译水平新蛋白的合成在一定程度上影响到1,25(OH)2D3上调STC-1表达的作用。2.1,25(OH)2D3对牛肾细胞凋亡的影响AO/EB染色结果表明,经100nmol/L1,25(OH)2D3处理后的MDBK细胞随着1,25(OH)2D3作用时间的增加,凋亡情况明显增强。流式细胞检测结果表明,在100nmol/L1,25(OH)2D3处理后,不同时间组的细胞凋亡率高于对照组,且在36h、48h、60h和72h上升极显著(P<0.01)。不同浓度1,25(OH)2D3处理MDBK牛肾细胞48h后,细胞凋亡率高于对照组,且在10nmol/L和100nmol/L上升极显著(P<0.01)。在100nmol/L1,25(OH)2D3处理MDBK牛肾细胞后,不同时间组的Fas基因表达量高于对照组,且在60和72h上升显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)；Bax基因表达量在12h至60h都上升,且在24h、36h和72h上升极显著(P<0.01)；Bcl-2基因表达量下降,且在60和72h下降极显著(P<0.01)。结论：本实验首次证实了1,25(OH)2D3对反刍动物牛的肾细胞中STC-1基因表达有上调作用,并发现1,25(OH)2D3主要通过转录水平使STC-1稳定表达。另外发现1,25(OH)2D3诱导牛肾细胞凋亡的发生,并在Fas.Bax和Bcl-2凋亡基因的水平上阐释诱导凋亡发生的机理。本实验为进一步研究STC-1的钙磷调节作用及其与1,25(OH)2D3之间的相互调节关系提供了新的实验依据,也为深入研究STC-1的生理作用、对细胞增殖凋亡作用和治疗奶牛钙磷代谢紊乱提供了新的资料。
【作者】马锐；
【导师】郭定宗；
【作者基本信息】华中农业大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】1,25（OH）2D3；STC-1；牛肾细胞；细胞凋亡；

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